医学检验初级中级职称考试小秘籍之免疫学检验 (记住这些基本80分以上)

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一、概论

1.免疫学是研究机体自我识别和对抗原异物排斥反应的一门学科,主要研究对象为具有免疫活性的物质

2.免疫反应正常条件下有利、异常条件下有害

3.免疫系统功能

①免疫防御功能:通过正常免疫应答,阻止和清除入侵病原体及其毒素的功能。

②免疫稳定功能:正常情况下机体可经常地清除损伤或衰老的自身细胞,并进行免疫调节,以维护体内生理平衡

③免疫监视功能:免疫系统具有的识别、杀伤并及时清除体内突变细胞,防止肿瘤发生的功能。

4.主动免疫与被动免疫区别:主动免疫是机体接受抗原(可以通俗地理解为致病物)产生的,而被动免疫是机体接受异体(即其他个体)产生的免疫细胞、抗体、细胞因子等而获得免疫力。天花是最早使用的免疫学方法预防的疾病

二、免疫组织与器官

1.免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成

2.中枢免疫器官包括骨髓和胸腺;外周免疫器官包括淋巴结、脾、黏膜伴随的淋巴组织

3.免疫功能表现为免疫防御、免疫自稳、免疫监视

4.淋巴结和脾是T、B细胞接触抗原后增殖的主要场所

三、免疫细胞

1.T祖细胞随血流迁移至胸腺、脾和淋巴结内发育成熟

为T细胞,T细胞又称为胸腺依赖淋巴细胞,发挥细胞免疫功能

2.B淋巴祖细胞在骨髓内发育成熟为B细胞,B细胞受抗原刺激后可分化为产生抗体的浆细胞,执行特异性体液免疫功能

3.自然杀伤细胞(NK细胞):来源于骨髓造血干细胞,可非特异性杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,分泌细胞因子参与体液免疫。不具备吞噬功能

四、免疫分子

1.免疫分子包括免疫球蛋白、补体系统、细胞因子、黏附分子、白细胞分化抗原

2.免疫球蛋白抗原结合位点位于H链及L链V区

3.免疫球蛋白包括

①IgG:唯一能通过胎盘的抗体,主要参与再次免疫应答

②sIgA:分泌型外分泌液中浓度最高,参与黏膜局部免疫的主要抗体

③IgM:为五聚体,分子量最大,个体发育最早合成的抗体,也是抗原刺激后体液免疫应答中最早出现的抗体。新生儿脐血中IgM最高,提示宫内感染

④IgE:介导I型超敏反应,在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高,在血清中含量最低

⑤IgD:含量较低

4.补体系统包括经典途径、替代途径、MBL途径

5.IgG和IgM为经典途径的主要激活剂

五、临床免疫学与免疫检验

1.特点:灵敏度高、特异性高、准确性好、方法简单、适用范围宽

2.免疫检验可检验免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞黏附分子、激素、酶、血浆微量蛋白、药物浓度、微量元素等

二、抗原抗体反应

1.抗原抗体结合力

①静电引力

②范德华引力:作用力最弱

③氢键结合力

④疏水作用力:结合作用最大

2.抗原抗体亲和性与亲和力

①亲和性:抗原抗体间的引力,是固有的结合力

②亲和力:抗体结合部位与抗原表位间结合的强度

3.抗体不会发生自然沉淀,抗原抗体结合后,蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体,便可形成可见的抗原抗体复合物,如加入电解质可加快反应(加Cl-形成沉淀最快)

4.抗原抗体反应的特点

①特异性:基于抗原决定簇

②可逆性

③比例性:只有当抗原抗体分子比例合适时,沉淀形成多而快。比例不适导致假阴性称为钩状效应,抗体过量为前带,抗原过剩为后带

④阶段性:第一阶段抗原抗体发生特异性结合,仅需几秒或几分钟;第二阶段为可见反应阶段,需数分钟至数小时

5.影响抗原抗体反应的因素

(1)反应物自身因素:应选择高特异性、高亲和力、高灵敏度的抗体作为诊断试剂

(2)环境因素

①电解质:常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为稀释液

②酸碱度:反应一般在pH6-8之间进行,有补体参与的抗原抗体反应最适pH为7.2-7.4

③温度:最常用反应温度为37℃

6.标记免疫技术是目前应用最广的免疫技术

三、免疫原和抗血清制备

一、免疫原制备

1.免疫原:诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞,并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质

2.抗原类型

①可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素等

②颗粒抗原包括细胞、细菌、寄生虫等

3.组织和可溶性抗原的粗提

(1)可溶性抗原包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等

(2)组织和可溶性抗原的粗提

①组织匀浆的制备:高速组织捣碎机法、研磨法

②细胞的破碎:反复冻融法、超声破碎法、自溶法、酶处理法、表面活性剂处理法

③免球蛋白片段的制备:共价键解离法、非共价键解离法、溴化氰裂解法、酶解法

(3)免疫球蛋白片段制备

①非共价键解离法

②共价键解离法

③溴化氰裂解法

④酶解法

4.可溶性抗原的提取和纯化方法

(1)超速离心法:仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原(亚细胞成分或大分子蛋白质)

(2)选择性沉淀法

①核酸去除法

②盐析法:最古老、经典的方法,不影响蛋白活性

③有机溶剂沉淀法

④聚合物沉淀法

(3)凝胶过滤法:利用抗原分子大小进行分离纯化

(4)离子交换法:根据抗原分子带电不同进行分离纯化

(5)亲和层析法:利用生物分子间具有的专一亲和力而设计的层析技术(抗原与抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等)

(6)电泳法:利用蛋白质带电量不同进行分离纯化

二、半抗原制备

1.半抗原(多肽、大多数的多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷)指某些物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性。与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性

2.载体包括

①蛋白质类:人血白蛋白、牛血白蛋白、血蓝蛋白等

②多肽聚合物

③大分子聚合物和某些颗粒:聚乙烯吡络烷酮、活性炭、羧甲基纤维素等

三、免疫佐剂

1.佐剂的种类

①化合物(无免疫活性):弗氏不完全佐剂(羊毛脂和液状石蜡)、氢氧化铝、明矾等

②生物制剂(有免疫活性):经处理改造的细菌及其代谢产物(卡介苗、枯草分枝杆菌等)、细胞因子及热休克蛋白等

2.最长用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂(不完全+卡介苗)和弗氏不完全佐剂

3.佐剂的生物学作用

①增强抗原免疫原性,使无(弱)抗原成为持久或强免疫原

②增强机体对抗原刺激的反应性,提高抗体效价

③促进抗体类型转换,IgM转变为IgG

④引起或增强迟发性超敏反应

四、免疫动物选择

1.抗原来源与动物种属关系越远越好

2.动物必须适龄、健壮、无感染、体重合乎要求。

3. 针对不同性质的免疫原,选用相应的动物。蛋白质抗原大部分动物皆适合;甾类激素多用家免;酶类多用豚鼠

五、免疫程序

1.免疫原的剂量:在一定范围内,免疫原剂量越大,产生的抗体效价越高

2.免疫途径

①初次免疫一般选择在皮内接种

②加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射

③宝贵抗原(抗原量较少)可选择淋巴结内微量注射

3.免疫间隔时间

①第1次与第2次免疫间隔时间以10-20天为佳,第3次及以后的间隔一般为7-10天

六、动物采血法

1.采血时间:动物经免疫3-5次后,如抗血清鉴定合格,应在5-7天及时采血

2.采血方法

①颈动脉采血法

②心脏采血法

③静脉采血法

七、抗血清的鉴定

1.抗体特异性鉴定:常用双向免疫扩散法

2.抗体效价的测定

①颗粒性抗原采用凝集试验

②可溶性抗原采用双向免疫扩散试验、ELLSA等方法

3.抗体纯度的鉴定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向免疫扩散试验、免疫电泳等

4.抗体亲和力鉴定

四、单克隆抗体与基因工程抗体的制备

一、单克隆抗体的制备及应用

1.单克隆抗体是由单一胞B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。

2.杂交瘤技术的融合剂为聚乙二醇

3.B淋巴杂交瘤技术用于制备单克隆抗体;T淋巴杂交瘤技术用于制备淋巴因子

4.杂交瘤细胞(小鼠骨髓细胞与脾细胞)冻存温度为-196℃,可长期保存

5.单克隆抗体的产生方法

①动物体内诱生方法:在小鼠腹腔注射医用液状石蜡或降植烷,1周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔,接种后10-14天无菌抽取腹水,离心取上清即可

②体外培养法

6.单克隆抗体的纯化与分型

(1)分型:常用免疫固定法

(2)纯化

①粗提:硫酸铵沉淀法、辛酸硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法

②纯化:离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和层析法(最有效)

7.单克隆抗体的特性

①高度特异性

②高度的均一性和可重复性

③弱凝集反应和不呈沉淀反应

④对环境敏感,易受pH、温度、和盐类浓度影响而活性降低

二、基因工程抗体及应用

1.基因工程抗体制备

①人源化抗体:人-鼠嵌合抗体和CDR植入抗体

②小分子抗体:包扩可变区片段(Fv)、单链可变区片段(ScFv)和单区抗体(SdAb)③抗体融合蛋白

④双特异性抗体:两个抗原结合位点特异性不同,可结合两种抗原分子

2.抗体融合蛋白:是指利用基因工程方法重组表达的抗体片段与其他生物活性蛋白融合的产物

3.抗体库技术

①组合抗体库:使轻、重链可变区随机组合,可产生新的轻重链配对法

②噬菌体抗体库技术:用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳表面

③核糖体展示

五、凝集反应

一、概述

1.凝集反应是颗粒抗原(细菌、螺旋体和红细胞、血小板等)与相应抗体结合后,在适当电解质存在下,形成肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应

2.参加凝集反应的抗原称为凝集原;抗体称为凝集素

3.凝集试验可用于定性或半定量检测,用效价或滴度表示凝集出现的最高稀释倍数

二、直接凝集反应

1.直接凝集反应的原理是颗粒性抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集

2.直接凝集试验包括玻片法和试管法

3.血型鉴定、外斐试验、肥达试验、交叉配血试验属于直接凝集反应

三、间接凝集反应

1.反应类型

①正向间接凝集反应:用已知抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体

②反向间接凝集反应:用已知特异性抗体检测标本中的相应抗原

③间接凝集抑制试验:间接凝集抑制反应 先将可溶性抗原(或抗体)与相应的抗体(或抗原)混合,然后再加入抗原(或抗体)致敏的载体颗粒,则能抑制原先的凝集现象,称为正向(或反向)间接凝集抑制试验。

④协同凝集反应:协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似,但所用载体为金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)。SPA可与IgG的Fc段结合;可用于抗原和抗体的检测

2.间接血凝试验:抗原(或抗体)包被于红细胞表面,成为致敏载体,然后与相应的抗体(或抗原)结合,从而使红细胞被动的凝聚在一起,出现可见的红细胞凝集现象。常用绵羊、家兔、鸡、人O型红细胞作为载体

3.乳胶凝集试验:以聚苯乙烯乳胶作为载体

4.明胶凝集试验:将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上,当致敏颗粒与样品血清作用时,若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集。

四、抗球蛋白试验(Coombs试验)

1.Coombs试验是建立在间接免疫凝集试验基础上进行的一种试验方法。用于检测抗红细胞不完全抗体

2. Coombs试验包括

①直接Coombs试验:检测红细胞上不完全抗体

②间接Coombs试验:血清中游离不完全抗体

六、沉淀反应

一、概述

1.沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象

2.沉淀反应反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质

3.沉淀反应分为两个阶段,第一阶段几秒到几十秒即可完成;第二阶段为形成可见的免疫复合物,约几十分钟到数小时才能完成

4.等价带:抗原抗体比例最适合,结合最充分、复合物最多、反应最明显、结果出现最快时称为等价带(最适比)

二、免疫浊度测定(液体内沉淀试验)

1.优点:①稳定性好②敏感度高③精确度高④简便快速⑤易于自动化

2.免疫比浊法的基本原理就是在反应体系中保持抗体适当过量

3.常用的增浊剂为聚乙二醇(PEG)、吐温-20、,可促进抗原抗体分子靠近,结合形成大分子复合物

4.使用R型抗体为小动物(兔子)产生的抗体;而不使用H型抗体为大动物(马)产生的抗体

5.免疫比浊法分类

①透射免疫比浊法

②散射免疫比浊法:终点散射比浊法、速率散射比浊法(应用广泛、结果较准确)

③免疫乳胶比浊法

6.可用于免疫球蛋白的定量检测

三、凝胶内沉淀试验

1.凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡萄糖或聚丙烯酰胺凝胶等

2.单向扩散试验

(1)单向扩散试验在琼脂内混入抗体,待抗原从局部向琼脂内自由扩散,如抗原抗体结合,则形成沉淀环

(2)单向扩散试验常用于IgA、IgM、IgG、C3、C4的定量测定

(3)如出现双环,说明有两种抗原相同成分存在

3.双向扩散试验

(1)双向扩散试验是让抗原抗体在琼脂中向对方扩散,在比例恰当出形成沉淀线

(2)结果判定

①沉淀线靠近抗原孔,表示抗体含量较多,抗原弱阳性

②沉淀线靠近抗体孔,表示抗原含量较多,抗体弱阳性

③沉淀线弯向哪一测,表示哪一测分子量大

(3)应用

①判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量

②分析抗原或抗体相对分子量

③分析抗原的性质

④滴定抗体的效价

⑤鉴定抗原或抗体纯度

四、免疫电泳技术

1.免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物,是直流电作用下的凝胶扩散试验

2. PI < pH ,蛋白质带负电,向正极移动

  PI > pH ,蛋白质带正电,向负极移动

3.对流免疫电泳

(1)对流免疫电泳实质上是将双相免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术

(2)大部分蛋白质抗原向正极移动,是由于带负电荷;作为抗体的IgG向负极移动,是由于电渗作用

4.火箭免疫电泳是单向免疫扩散与电泳相结合,如沉淀定分呈不清楚的云雾状或圆形,提示电泳未到终点

5.免疫电泳是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫分析技术

6.免疫固定电泳是将区带电泳与免疫沉淀技术结合,可用于各种蛋白的分型及鉴定(M蛋白、免疫球蛋白)

7.交叉免疫电泳是将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的技术

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      5月前